کیت الایزا پیشتاز طب - Vitamin D

مشخصات کیت الایزا ویتامین دی پیشتاز طب

مواد ارائه شده به همراه کیت الایزا ویتامین دی پیشتاز طب:

1. چاهک های پوشش داده شده با آنتی بادی (۲پلیت، ۹۶ چاه): چاه های میکروتیتر پوشش داده شده با مونوکلونال آنتی 25OH ویتامین D.
2. بافر سنجش (۱ ویال، ۱۵ میلی لیتر): حاوی محلول بافر سنجش (آماده به مصرف)
3. بافر استخراج (۱ ویال، ۱۵ میلی لیتر): بافری که برای آزادسازی ویتامین D از پروتئین اتصال دهنده آن (ویتامین D باندینگ پروتئین) آماده استفاده است.
   • توجه: بلافاصله پس از برداشتن محلول مورد نیاز درب ویال را ببندید تا از تبخیر جلوگیری شود.
4. آنزیم مزدوج (محلول غلیظ  ۲۰ X ویال، ۵/۱ میلی لیتر): حاوی ۲۵ OH ویتامین-D بیوتینیله است.
5. بافر رقیق کننده مزدوج (۲ ویال، ۱۵ میلی لیتر): برای رقیق سازی کنژوگه آنزیم استفاده می شود.
6. مجموعه استاندارد (۶ ویال/۲ میلی لیتر): حاوی ۰، ۵، ۱۰، ۳۰، ۶۰ و ۱۲۰ نانوگرم در میلی لیتر ویتامین D 25-OH کالیبره شده بر اساس پروتکل برنامه استانداردسازی ویتامینD (VDSP)  توسط مواد مرجع استاندارد NIST (SRM)-972.
7. کنترل سرم (۲ ویال، ۲ میلی لیتر): حاوی کنترل های سرمی با غلظت های مشخص ذکر شده بر روی برچسب.
8. محلول شستشو (۲ ویال، ۵۰ میلی لیتر، ۲۰ برابر غلیظ): حاوی محلول بافر فسفات با ۰.۰۵% Tween 20 است. برای تهیه شستشو، محلول محلول غلیظ شستشو را به نسبت ۱:۲۰ با آب مقطر رقیق می کند.
9. معرف سوبسترای کروموژن (۲ ویال، ۱۲ میلی لیتر): حاوی تترا متیل بنزیدین (TMB) و پراکسید هیدروژن ( آماده استفاده)
10. محلول توقف (۲ ویال، ۱۲ میلی لیتر): حاوی ۱ مولار اسید کلریدریک. (محلول آماده مصرف)

مواد/تجهیزات مورد نیاز که همراه با کیت الایزا ویتامین دی پیشتاز طب ارائه نشده است:

1. الایزا ریدر میکروپلیت با قابلیت جذب طول موج ۴۵۰ نانومتر (و ۶۳۰ نانومتر).
2. میکرو پیپت های دقیقی که می توانند ۱۰ تا ۱۰۰ میکرولیتر را تحویل دهند.
3. دستگاه انکوباتور کالیبره شده ۳۷ درجه سانتیگراد
4. حوله جاذب
5. آب مقطر

موارد عمومی برای کاربران:

• معرف های کیت الایزا ویتامین دی پیشتاز طب را با شماره های مختلف مخلوط نکنید.
• تمام اجزای کیت الایزا ویتامین دی پیشتاز طب باید فقط در کیت اصلی خود استفاده شوند
• تمام معرف های به دست آمده از منابع انسانی برای HBs Ag، آنتی بادی HCV و آنتی بادی HIV منفی هستند. برای جلوگیری از خطر آلودگی، از تجهیزات حفاظت فردی مانند دستکش، روپوش آزمایشگاهی و غیره استفاده کنید و از تماس مستقیم با معرف ها خودداری کنید.

شرایط نگهداری کیت الایزا ویتامین دی پیشتاز طب

1. کیت باید هنگام تحویل گرفتن و در صورت عدم استفاده در دمای  ˚C2-8  نگهداری شود.
2. چاهک های استفاده نشده را در کیسه مهر و موم شده خود با مواد خشک کننده ( نمگیر) نگهداری کنید.
3. از معرف های تاریخ مصرف گذشته استفاده نکنید.
4. پس از آماده سازی، محلول شستشوی رقیق شده (۱:۲۰) در دمای ۸-۲ درجه سانتی گراد به مدت ۱ هفته پایدار است.

جمع آوری و ذخیره سازی نمونه

این کیت الایزا ویتامین دی پیشتاز طب برای استفاده با نمونه سرم می باشد. نمونه سرم باید از یک نمونه خون کامل تهیه شود.

سرم تازه نمونه انتخابی این کیت است. با این حال، اگر آزمایش را نمی توان ظرف یک ساعت پس از آماده سازی سرم انجام داد، نمونه های سرم را بلافاصله در یخچال (حداکثر ۴۸ ساعت) در یخچال قرار دهید و اجازه دهید قبل از آزمایش به دمای اتاق برگردند. در صورت نیاز به نگهداری طولانی مدت، نمونه ها باید در دمای ۲۰- درجه سانتیگراد (حداکثر ۷ روز) نگهداری شوند. از تکرار چرخه های انجماد و ذوب خودداری کنید.

آماده سازی معرف ها

1. تمام معرف ها باید قبل از استفاده به دمای اتاق)۲۲-۲۸ درجه سانتیگراد) برسند.
2. روش تست باید به صورت متوالی و بدون وقفه انجام شود.
3. محلول شستشوی کار: محلول شستشوی غلیظ ۲۰ برابر را با اضافه کردن آب مقطر قبل از استفاده رقیق کنید (یعنی ۵۰ میلی لیتر محلول شستشو باید به ۱۰۰۰ میلی لیتر رقیق شود). محلول را می توان در دمای ۸-۲ درجه سانتی گراد به مدت یک هفته نگهداری کرد.
4. اندازه گیری فتومتریک شدت رنگ باید ظرف ۳۰ دقیقه پس از افزودن محلول stop  انجام شود.
5. برای حصول بهترین نتیجه، شستشوی چاه ها به طور کامل انجام شود و تمام قطرات باقیمانده با ضربه زدن به صفحه روی کاغذ جاذب پاک شود.
6. مدت زمان آزمایش شامل زمان انکوباسیون یکی از عوامل اصلی در حصول بهترین نتایج است. بنابراین، لطفا قبل از اجرای آزمایش، مواد و معرف های مورد نیاز (به جز محلول کار مزدوج) را تهیه کنید تا زمان نمونه برداری کاهش یابد.
7. بافر واکنش باید با افزودن حجم مساوی از بافر Assay و بافر Extraction تهیه شود. آزمایش را در عرض ۵ دقیقه پس از آماده سازی انجام دهید.

روش انجام آزمایش:

1. تعداد مورد نظر چاهک میکروپلیت را در نگهدارنده محکم کنید و باقیمانده را با ماده خشک کن در یک کیسه اصلی محکم در بسته نگهداری کنید.
2. ۲۰ میکرولیتر از هر استاندارد، سرم کنترل و نمونه را در چاهک های مناسب توزیع کنید. توصیه می شود نمونه ها و استانداردها را در دو نسخه اجرا کنید و میانگین OD (چگالی نوری) هر کدام را به عنوان نتیجه نهایی محاسبه کنید.
3. ۱۰۰ میکرولیتر از بافر واکنش را به هر چاهک اضافه کنید. به منظور تهیه بافر واکنش در هر چاهک، ۷۵ میکرولیتر بافر استخراج و ۷۵ میکرولیتر بافر سنجش را در یک لوله اضافه کنید و خوب مخلوط کنید.
4. میکروپلیت را به مدت ۲ دقیقه به آرامی تکان دهید تا محتویات مخلوط شوند. سپس چاه های میکروتیتر را با سیلر مقوایی بپوشانید. آن را به مدت ۴۵ دقیقه در انکوباتور ۳۷ درجه سانتیگراد انکوبه کنید.
   • نکته مهم: به تکان دادن پلیت ادامه دهید تا محتویات چاهک ها کاملاً مخلوط شوند تا رنگی یکدست به دست آید. برای تکان دادن میکروپلیت با سرعت ۵۰۰ دور در دقیقه به مدت ۲ دقیقه می توان از شیکر صفحه استفاده کرد.
5. پس از زمان انکوباسیون، محتویات چاهک ها را با تکان دادن میکروپلیت در ظرف زباله خارج کنید. چاهک های میکروتیتر را ۵ بار بشویید و تکان دهید (هر بار با ۳۰۰ میکرولیتر محلول شستشو). چاهک ها را به شدت روی کاغذ جاذب یا دستمال کاغذی بزنید تا تمام قطرات باقیمانده محلول شستشو از بین برود. (از هر گونه زمان خیساندن در مرحله شستشو خودداری کنید)
6. ۱۰۰ میکرولیتر از معرف کار مزدوج را در هر چاهک به جز چاهک خالی بریزید. برای تهیه معرف مزدوج کار، رقیق کنید. کنژوگه آنزیم غلیظ ۱:۲۰ با رقیق کننده مزدوج، (برای هر نوار ۵۰ میکرولیتر محلول کنژوگه غلیظ را به ۹۵۰ میکرولیتر بافر رقیق کننده مزدوج اضافه کنید و خوب مخلوط کنید.) برای جلوگیری از کاهش مقدار O.D، تهیه مزدوج توصیه می شود. پس از اتمام اولین زمان انکوباسیون بافر کار می کند.
7. چاهک های میکروتیتر را با سیلر مقوایی بپوشانید و به مدت ۱۵ دقیقه در انکوباتور ۳۷ درجه سانتیگراد انکوبه کنید.
8. پس از زمان انکوباسیون، محتویات چاهک ها را با تکان دادن میکروپلیت در ظرف زباله خارج کنید. چاهک های میکروتیتر را ۵ بار بشویید و تکان دهید (هر بار با ۳۰۰ میکرولیتر محلول شستشو). (از هر گونه زمان خیساندن در مرحله شستشو خودداری کنید). چاهک ها را به شدت روی کاغذ جاذب یا دستمال کاغذی بزنید تا تمام قطرات باقیمانده محلول شستشو از بین برود.
9. ۱۰۰ میکرولیتر محلول سوبسترای کروموژن را در هر چاهک بریزید.
10. میکروپلیت را به مدت ۱۵ دقیقه در دمای اتاق و در تاریکی انکوبه کنید.
11. ۱۰۰ میکرولیتر محلول stop را به چاهک اضافه کنید تا واکنش متوقف شود. خواندن جذب در ۴۵۰ نانومتر توسط الایزا ریدر. (در صورت موجود بودن از فیلتر ۶۳۰ نانومتری به عنوان فیلتر مرجع استفاده کنید)

محاسبه نتایج

1. مقدار متوسط جذب استانداردها و نمونه ها را در ۴۵۰ نانومتر محاسبه کنید (در صورت موجود بودن از فیلتر ۶۳۰ نانومتری به عنوان فیلتر مرجع استفاده کنید).
2. یک منحنی استاندارد نقطه به نقطه با رسم میانگین جذب به دست آمده برای هر استاندارد مرجع در برابر غلظت آن بر حسب ng/ml بر روی کاغذ گراف خطی، با جذب در محور عمودی (Y)  و غلظت در محور افقی (X) بسازید..
3. از مقدار میانگین جذب برای هر نمونه استفاده کنید. غلظت متناظر ۲۵-OHVitamin D را بر حسب ng/ml از منحنی استاندارد تعیین کنید.
4. نتایج یک منحنی استاندارد معمولی ELISA 25-OH-Vitamin-D در جدول ۱ نشان داده شده است.

جدول ۱: مثالی از منحنی استاندارد

جذب متوسط (۴۵۰-۶۳۰ nm )	استاندارد ها (ng/ml)
۵/۲	۰	St1
۲۶/۱	۵	St2
۹۷/۰	۱۰	St3
۵۸/۰	۳۰	St4
۳۴/۰	۶۰	St5
۱۸/۰	۱۲۰	St6

جداول شماره ۱: تحلیل کیت الایزا ویتامین دی پیشتاز طب (ویتامین د۳ کوله کلسیفرول)

 

نکته ۱: مثال صرفاً برای توضیح است و نباید برای محاسبه مجهولات استفاده شود. کاربران باید منحنی استاندارد خود را در هر اجرا بدست آورند.

نکته ۲: مقادیر بیشتر از ng/ml 120 باید بیش از ۱۲۰ ng/ml گزارش شود.

مقادیر مورد انتظار:

هر آزمایشگاه باید محدوده نرمال خود را بر اساس جمعیت بیمار تعیین کند. بر اساس تعداد محدودی از نمونه های خون بالغ سالم، میانگین غلظت ۲۵ OH ویتامین-D در جدول بعد از صفحه نشان داده شده است.

جدول ۲: مقدار مورد انتظار ۲۵ OH-Vitamin-D

محدوده (ng/ml)	سطح
۲۰˂	بسیار کم
۲۰-۲۹	ناکافی
۳۰-۱۰۰	مناسب و کافی
۱۰۰˃	بصورت بالقوه سمی

جداول شماره ۲: تحلیل کیت الایزا ویتامین دی پیشتاز طب (ویتامین د۳ کوله کلسیفرول)

تبدیل واحد برای مقادیر ۲۵ OH-Vitamin-D

فرمول زیر را می توان برای تبدیل واحد غلظت ۲۵ OH ویتامین-D به nmol/L استفاده کرد:

ng/ml × ۲.۵ = nmol/L

مثال:

مقدار ۲۵ نانوگرم در میلی لیتر پس از اعمال فرمول فوق ۶۲.۵ نانومول بر لیتر است.

محدودیت های آزمون

سطح ۲۵ OH ویتامین D نباید به عنوان یک شاخص مطلق وجود یا عدم وجود بیماری استفاده شود.

نتایج آزمایش تنها باید در ترکیب با سایر تست های آزمایشگاهی و روش های تشخیصی در روند نظارت بر درمان بیمار تفسیر شود.

تکان دادن ناکافی صفحه برای مخلوط کردن محتویات آن (بافر واکنش) باعث تغییر در نتیجه می شود.

به دلیل وجود آنتی بادی های هتروفیل در سرم برخی از بیماران، با وجود مواد مسدود کننده قوی ضد هتروفیل در محلول های کیت الایزا ویتامین دی پیشتاز طب ، امکان تداخل در آزمایش وجود خواهد داشت.

از استفاده از نمونه های همولیز شده خودداری کنید.

ویژگی های عملکردی

۱. حساسیت

حداقل غلظت قابل تشخیص ۲۵ OH-Vitamin-D با چگالی نوری (OD) استانداردهای صفر منهای سه برابر انحراف استاندارد (SD) تعیین شد.

حساسیت کیت الایزا ویتامین دی پیشتاز طب ۲۵ OH-Vitamin-D 3.5 ng/ml است و مقادیر کمتر از این مقدار باید <3.5ng/ml گزارش شود.

۲. دقت

۲-۱ Intra-assay

Intra-assay با تکرار تعیین سه نمونه سرم مختلف با غلظت شناخته شده در یک اجرا مشخص شد.

CV%	SD	میانگین (ng/ml)	تعداد تست های انجام شده	شماره نمونه
۲/۱۴	۷/۱	۱۲	۱۰	۱
۱/۴	۲۱/۲	۵۴	۱۰	۲
۲/۲	۲۸/۲	۱۰۴	۱۰	۳

جداول شماره ۳: تحلیل کیت الایزا ویتامین دی پیشتاز طب (ویتامین د۳ کوله کلسیفرول)

۲-۲ Inter-assay

Inter-assay با تکرار اندازه‌گیری‌های سه نمونه سرم مختلف با غلظت شناخته شده در ۲۴ اجرا مختلف تعیین شد.

CV%	SD	میانگین (ng/ml)	تعداد تست های انجام شده	شماره نمونه
۷/۱۶	۷۱/۱	۱۰.۲۶	۲۴	۱
۱۱	۶۶/۳	۳۳.۲۶	۲۴	۲
۴/۳	۸/۳	۱۱۲	۲۴	۳

جداول شماره ۴: تحلیل کیت الایزا ویتامین دی پیشتاز طب (ویتامین د۳ کوله کلسیفرول)

۳. اختصاصیت

ویژگی این تست الایزا ۲۵ OH-Vitamin-D با افزودن متابولیت های مختلف ویتامین D به نمونه های سرم تعیین شد. نتایج واکنش های متقاطع در جدول زیر نشان داده شده است.

واکنش متقابل %	غلظت  (ng/ml)	واکنش دهنده های متقاطع
۱۰۰	۱۰	۲۵-OH-Vitamin-D3
۱۰۰	۱۰	۲۵-OH-Vitamin-D2
۹.۵	۱۰۰	۱, ۲۵-OH-Vitamin-D3
۶	۷۰	۱, ۲۵-OH-Vitamin-D2
˂۰.۱	۲۵	Vitamin-D3
۰.۵˂	۲۰	Vitamin-D2
۳.۵	۵۰	۲۴, ۲۵-OH-Vitamin-D3
۵	۲۰	۳- epi-25-OH-VitaminD2
۱.۵	۲۰	۳- epi-25-OH-VitaminD3

جداول شماره ۵: تحلیل کیت الایزا ویتامین دی پیشتاز طب (ویتامین د۳ کوله کلسیفرول)

۴. بازیابی

مقادیر مشخصی از۲۵ OH-Vitamin-D به ۴ سرم مختلف با غلظت های شناخته شده۲۵ OH-Vitamin-D اضافه شد و بازیابی آنها تعیین شد. نتایج در جدول بعد از صفحه نشان داده شده است:

بازیابی%	مقدار مشاهده شده (ng/ml)	مقدار مورد انتظار (ng/ml)	افزوده شدن 25OHVitaminD	25OHVitaminD در سرم	شماره نمونه
۹۵.۲	۱۱.۹	۱۲.۵	۱۰	۱۵	۱
۹۵	۱۹	۲۰	۲۵	۱۵	۱
۹۵.۲	۴۰.۵	۴۲.۵	۷۰	۱۵	۱
۱۰۴.۱	۲۵	۲۴	۱۰	۳۸	۲
۱۰۱.۵	۳۲	۳۱.۵	۲۵	۳۸	۲
۱۰۴.۶	۵۶.۵	۵۴	۷۰	۳۸	۲
۹۷.۱	۳۳.۵	۳۴.۵	۱۰	۵۹	۳
۹۵.۲	۴۰	۴۲	۲۵	۵۹	۳
۹۶.۱	۶۲	۶۴.۵	۷۰	۵۹	۳
۱۰۴.۴	۵۹.۵	۵۷	۱۰	۱۰۴	۴
۱۰۲.۳	۶۶	۶۴.۵	۲۵	۱۰۴	۴
۱۰۴.۶	۹۱	۸۷	۷۰	۱۰۴	۴

جداول شماره ۶: تحلیل کیت الایزا ویتامین دی پیشتاز طب (ویتامین د۳ کوله کلسیفرول)

۵. خطی بودن

برای بررسی خطی بودن آزمون، پنج نمونه سرم مختلف با غلظت مشخص ۲۵-OH-ویتامین-D با صفر استاندارد (st.0) رقیق شده و توسط این کیت الایزا ویتامین دی پیشتاز طب مورد آزمایش قرار گرفتند. نتایج در جدول زیر نشان داده شده است:

بازیابی%				نمونه رقیق نشده 25OH-Vitamin-D	شماره نمونه
۱:۱۶	۱:۸	۱:۴	۱:۲
*	*	۱۰۸	۱۱۰	۱۸.۳	۱
*	۹۷	۹۳	۹۲	۳۷.۳	۲
۸۹	۹۲	۱۱۱	۹۸	۵۸.۹	۳
۱۱۵	۱۰۸	۱۰۶	۱۰۳	۹۵	۴
۱۱۶	۹۲	۱۰۳	۱۰۴	۱۱۲	۵

جداول شماره ۷: تحلیل کیت الایزا ویتامین دی پیشتاز طب (ویتامین د۳ کوله کلسیفرول)