کیت الایزا پیشتاز طب - Calprotectin

مشخصات کیت الیزای کلپروتکتین پیشتاز طب

کلپروتکتین یک پروتئین اتصال دهنده به کلسیم و روی است که از خانواده پروتئین های S100 و یک دایمر ۲۴ کیلو دالتون است که توسط مونومرهای S100A8 و S100A9 تشکیل شده است. کلپروتکتین تقریباً ۶۰ درصد از پروتئین های سیتوزولی در نوتروفیل ها را تشکیل می­دهد. خاصیت باکتری کشی و قارچ کشی دارد و در هنگام عفونت و التهاب ۵ تا ۴۰ برابر افزایش می­یابد.

غلظت کلپروتکتین در نمونه های مدفوع ۶ برابر بیشتر از پلاسمای خون است. بنابراین به عنوان یک نشانگر غیر تهاجمی قابل اعتماد برای بیماری های التهابی روده مانند کولیت اولسراتیو و بیماری کرون عمل می­کند.

افزایش مقادیر کلپروتکتین شاخصی برای موارد زیر است:

• بیماری التهابی حاد و مزمن روده (IBD)
• تمایز بین بیماری التهابی فعال روده و سندرم روده تحریک پذیر (IBS)
• پایش بیماری کرون و کولیت اولسراتیو

اساس آزمایش کلپروتکتین Calprotectin

کیت الایزا کالپروتکتین پیشتاز طب بر اساس اصل Sandwich ELISA برای اندازه گیری کمی مقدار کلپروتکتین در نمونه مدفوع در نظر گرفته شده است. به منظور انجام آزمایش کلپروتکتین، با استفاده از بافر مخصوص کلپروتکتین موجود در نمونه مدفوع استخراج می شود، و میزان کلپروتکتین موجود در نمونه استخراج شده با روش الایزای ساندویچ اندازه گیری می­شود.

 نمونه های آزمایشی، استانداردها و آنتی بادی های تشخیصی که بیوتینیله هستند به چاهک های از قبل پوشش داده شده با آنتی بادی جذب اضافه شده و سپس با بافر شستشو شسته می­شود.

HRP-Streptavidin اضافه می­شود و هر کونژوگه غیر متصل با استفاده از Wash Buffer شسته می­شود.

واکنش آنزیمی HRP با افزودن سوبسترای TMB شناسایی می­شود. در نهایت، واکنش با یک محلول توقف اسیدی خاتمه می­یابد.

 رنگ ایجاد شده متناسب با مقدار Calprotectin در نمونه یا استاندارد است. غلظت کلپروتکتین انسانی مدفوع در نمونه های آزمایشی مستقیماً از این منحنی استاندارد تعیین می­شود.

محتویات کیت

محتویات کیت	توضیح	۹۶ تستی
پلیت :	حاوی چاهک­های کوت شده با آنتی بادی­های اختصاصی ضد کلپروتکتین	۱ × ۹۶ Well
بافر استخراج نمونه مدفوع(Extraction Buffer) :	دو ویال حاوی بافر استخراج نمونه (آماده مصرف می باشد) .	۲×۱۰۰ ml
محلول رقیق کننده نمونه (Sample Diluent) :	یک ویال  که حاوی بافر رقیق کننده نمونه استخراج شده است (آماده مصرف می باشد).	۱×۵۰ ml
محلول آنزیم کونژوگه (Enzyme Conj.) :	یک ویال حاوی محلول کونژوگه ;که با آنتی بادی ضد کلپروتکتین کنژوگه شده است(آماده مصرف می­باشد).	۱×۱۲ m
مجموعه ای از استانداردها (Set standards):	شامل ۶ ویال استاندارد است که با غلظت های مختلف معادل صفر، ۲۵ ،۵۰ ،۲۰۰ ،۴۰۰ و ۶۰۰ میکروگرم کلپروتکتین در هر گرم مدفوع می­باشد.	St. 6×۱ ml
نمونه های کنترل (پایین و بالا) :	دو ویال، که حاوی نمونه کنترل با غلظت مشخص هستند.	۲×۱ ml
محلول رنگزای یک مرحله ای (Substrate-Chromogen) :	یک ویال حاوی محلول سوبسترا-رنگزا	۱×۱۲ ml
محلول شستشو (Wash Solution):	یک ویال حاوی محلول شستشوی غلیظ  با غلظت  20X به  به منظور تهیه محلول شستشوی آماده مصرف، مقدار مورد نیاز را با آب مقطر به نسبت ۲۰/۱ رقیق نمایید. (نگهداری ۲-۸ درجه سانتی گراد)	۱×۵۰ ml
محلول متوقف کننده(Stop Solution) :	یک ویال حاوی اسید کلریدریک (HCl) 1 نرمال .	۱×۱۲ ml

جدول ۱ – محتویات کیت الایزا کالپروتکتین پیشتاز طب (آزمایش کلپروتکتین Calprotectin)

شرایط نگهداری:

1. دمای نگهداری کیت ۲-۸ درجه سانتی گراد می­باشد.
2. چاهک­ها را در کیسه مخصوص پلیت به همراه رطوبت گیر نگهداری نمایید.
3. مدت زمان پایداری محتویات کیت الایزا کالپروتکتین پیشتاز طب تا زمان انقضای نوشته شده بر روی هر یک از آن ها می باشد.
4. محلول شستشو که به نسبت ۲۰/۱ با آب مقطر رقیق شده باشد و آماده به مصرف گردیده است،  به مدت یک هفته در دمای ۲ تا ۸ درجه سانتیگراد قابل نگهداری و مصرف می­ باشد.

مراحل آزمایش و کار با کیت الایزا کالپروتکتین پیشتاز طب

جمع آوری و نگهداری نمونه:

مقدار کمی از نمونه مدفوع برای انجام آزمایش کلپروتکتین جمع آوری شود. نمونه مدفوع باید ظرف حداکثر ۴ روز مورد آزمایش کلپروتکتین قرار گیرد. در صورت نگهداری نمونه به مدت طولانی باید در دمای ۲۰- درجه سانتی گراد نگهداری شود.

قبل از انجام استخراج کلپروتکتین از نمونه مدفوع نمونه باید به دمای اتاق برسد و به خوبی هموژنیزه شود.

استخراج کلپروتکتین از نمونه مدفوع:

• روش نمونه برداری وزنی
• نمونه برداری تقریبی

روش نمونه برداری ورزنی:

استخراج کلپروتکتین از نمونه مدفوع با استفاده از روش نمونه برداری وزنی به شرح زیر است.

• تنظیم ترازوی دیجیتال با قرار دادن یک لوله آزمایش درب پیچ دار خالی به همراه لوپ نمونه گیری یک بار مصرف درون آن
• برداشت ۲۰ تا۴۰ میلیگرم از نمونه مدفوع هموژنیزه با استفاده از لوپ نمونه گیری به درون تیوب
• قرار دادن لوپ آغشته به نمونه به درون تیوب و تعیین وزن نمونه
• اضافه کردن بافر استخراج به نسبت ۱ به ۵۰ به نمونه
• ورتکس محتویات تیوب به مدت ۳۰ ثانیه
• مخلوط کردن محتویات تیوب به مدت ۳۰ دقیقه با استفاده از شیکر
• سانتریفیوژ تیوب ها به مدت ۳۰ دقیقه در xg3000
• انتقال محلول رویی به تیوب جدید (رسوب را دور بریزید)
• نگهداری نمونه استخراج شده به مدت حداکثر ۵ روز در دمای ۲ تا ۸ درجه سانتیگراد و برای مدت طولانی در دمای ۲۰ -درجه سانتیگراد یا پایین تر

روش نمونه برداری تقریبی:

استخراج کلپروتکتین از نمونه مدفوع با استفاده از روش تقریبی به شرح زیر است.

• اضافه کردن ۲ میلی لیتر بافر استخراج به درون هر تیوب
• برداشت حدود ۴۰ میلی گرم  از مدفوع به وسیله لوپ اسپیرال (لوپ اسپیرال را در ۵ نقطه مختلف از نمونه مدفوع تا عمق ۵ میلی متر فرو ببرید)
• قرارگیری لوپ به داخل تیوب
• ورتکس، به گونه ای که نمونه به طور کامل در بافر حل شود
• نگهداشتن تیوب به مدت ۵ دقیقه به صورت ساکن
• استفاده از محلول رویی به عنوان نمونه استخراج شده

مراحل آزمایش کلپروتکتین:

1. رقیق کردن نمونه های مدفوع استخراج شده به نسبت ۱ به ۵۰ با استفاده از بافر رقیق کننده
2. ریختن ۱۰۰ میکرولیتر از هر کدام از نمونه های استاندارد کنترل و نمونه رقیق شده درون هر چاهک
3. پوشاندن چاهک ها برچسب مخصوص پلیت و قرار دادن میکروپلیت ها بر روی شیکر به مدت ۳۰ دقیقه
4. خالی کردن محتویات چاهک ها و ۵ مرتبه شستن هر چاهک با محلول شست و شو (۳۰۰ میکرولیتر)
5. اضافه کردن ۱۰۰ میکرولیتر از محلول آنزیم کونژوگه به هر چاهک
6. پوشاندن چاهک ها با برچسب مخصوص و  قرار دادن میکروپلیت­ها بر روی شیکر به مدت ۳۰ دقیقه
7. خالی کردن محتویات چاهک­ها و ۵ مرتبه شستن هر چاهک با محلول شست و شو (۳۰۰ میکرولیتر)
8. اضافه کردن ۱۰۰ میکرولیتر محلول رنگزا به هر چاهک
9. قرار دادن چاهک ها در تاریکی و دمای اتاق به مدت ۱۵ دقیقه
10. اضافه کردن ۱۰۰ میکرولیتر محلول متوقف کننده به هر چاهک(به منظور توقف واکنش­های آنزیمی)
11. استفاده از دستگاه الیزا ریدر با فیلتر nm450 به منظور سنجش جذب نوری

محدودیت­های آزمایش کلپروتکتین:

• در صورت مثبت شدن کلپروتکتین در مدفوع به تنهایی دال بر تشخیص IBD نمی­باشد و می بایست به علائم بالینی و تاریخچه بیمار نیز توجه گردد.
• به منظور بررسی تغییر میزان کلپروتکتین مدفوع و پیگیری درمان بیماری می­بایست از روش استخراج وزنی برای نمونه مدفوع استفاده شود.
• فرم فعال و غیر فعال بیماری التهابی روده (IBD) در بیماران مبتلا دارای نوسان است به همین جهت ممکن است نتایج آزمایش کلپروتکتین دارای نوسان باشد.
• در صورتی که خونریزی مجاری گوارشی بیشتر از ۱۰۰ میلی لیتر در روز باشد روی غلظت کلپروتکتین اثر می­گذارد و غلظت آن را تا حدود g/μg 15 افزایش می دهد.
• بیماری­هایی مانند عفونت دستگاه گوارش و سرطان روده بزرگ می تواند غلظت کلپروتکتین را افزایش دهد.